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| 1 | 米曲霉pyrG基因克隆及其同源转化系统的建立显示文摘建立以乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因(pyrG)为选择标志,以米曲霉为宿主菌的同源转化系统。以米曲霉基因组为模板,通过PCR扩增获得pyrG基因,将该片段与表达载体pMD18-T相连,转化大肠杆菌DH5α,经蓝白斑筛选、PCR快速筛选、酶切和测序验证,获得重组质粒pMD-pyrG,完成pyrG基因的克隆。序列分析表明该基因与米曲霉KBN616的pyrG基因编码序列的同源性为99.9%,两者经推导的氨基酸的同源性为99.6%。以米曲霉pyrG营养缺陷株为受体菌,通过PEG/CaCl2诱导的原生质体转化方法,将重组质粒导入该受体菌,使米曲霉pyrG缺陷株发生基因转化,成为pyrG+,由此成功建立了以pyrG为筛选标记基因、同型米曲霉pyrG基因缺陷株为受体菌的基因转化系统。 | 王金良 陈宏文 | 2010 | 食品科学2010，31，11： | 7 |
| 2 | 耐热植酸酶基因phyA的克隆及新型表达载体的构建显示文摘目的 克隆烟曲霉耐热植酸酶基因 ,构建分泌性的真核表达质粒 ,以获取耐热的基因工程植酸酶。方法 提取烟曲霉菌的基因组 ,以此为模板PCR扩增成熟肽编码序列 ,双酶切后与包含黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和基因片断的真核表达载体 pYG 1 .2相连接 ,转化入大肠杆菌DH5α ,从转化菌株中提取质粒进行序列测定和分析。 结果 PCR扩增出 1 32 6bp的植酸酶编码序列 ,插入 pYG 1 .2质粒中 ,构建了重组质粒 ,重复实验结果表明 ,该植酸酶基因序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列有 2个碱基的差异 ,编码的蛋白质序列有 99.8%的同源性。结论 成功构建了用于黑曲霉菌真核表达耐热植酸酶的重组质粒。 | 李佳 刘钟滨 | 2004 | 同济大学学报(医学版)2004，25，6： | 6 |
| 3 | 烟曲霉菌热稳定性植酸酶在黑曲霉菌中的分泌性表达显示文摘在先前克隆获得烟曲霉菌植酸酶phyA基因并构建了重组质粒的基础上,将该质粒转化黑曲霉菌pyrG基因缺陷株M54;同时制备植酸酶多克隆抗体用于植酸酶的免疫学检测。SDS-PAGE和western-blot结果表明,phyA在黑曲霉菌中获得分泌性表达。表达产物活性测定结果显示,重组植酸酶的表达量为597.6 IU/mL。在90℃加热10 min和100℃加热20 min后,重组植酸酶残余酶活分别为74%和70%,具有较好的热稳定性。实现了烟曲霉菌植酸酶在黑曲霉菌中的分泌性表达,表达产物具较高的生物活性和耐热性。 | 李佳 刘钟滨 | 2007 | 微生物学杂志2007，27，3： | 4 |
| 4 | 嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶的异源表达及酶学性质研究显示文摘运用生物信息学技术从嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)CICC20156中克隆获得羧酸酯酶基因,构建黑曲霉和毕氏酵母表达质粒,将重组质粒分别转化毕氏酵母GS115和黑曲霉pyrG基因缺陷株M54.SDS-PAGE和Westernblot检测显示:携带His标记的外源蛋白在转化真菌宿主中均获得了高效分泌性表达,毕氏酵母和黑曲霉表达的外源蛋白分子质量均约为29ku,蛋白质浓度分别为30.7mg/L和15.3mg/L.生物学活性测定表明,毕氏酵母与黑曲霉表达的羧酸酯酶单位蛋白酶活分别为22671U/mg和21438U/mg.酶学性质研究显示,两种表达系统表达的重组羧酸酯酶的酶学特性基本一致,它们在40~70℃范围内均显示较好的酶活性,最适反应温度为60℃.70℃处理30min,毕氏酵母和黑曲霉表达重组羧酸酯酶残余酶活分别为76.7%和67.6%,显示出良好的热稳定性.在pH6.5~8.5的范围内显示较高酶活性,最适pH为8.0.上述研究首次实现了具有良好热稳定性的嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶在黑曲霉和毕氏酵母中高效异源分泌性表达,其中毕氏酵母羧酸酯酶的产量要高于黑曲霉的酶产量,但考虑到重组黑曲霉表达外源性蛋白无需使用任何诱导剂,黑曲霉菌表达热稳定性羧酸酯酶可能具有更好的应用前景. | 孙锦霞 刘钟滨 | 2010 | 生物化学与生物物理进展2010，37，9： | 2 |
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