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| 1 | 草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果显示文摘为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14~20 cm,60~120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。 | 刘林 徐诗英 李婧慧 邹勇 倪金俤 杨鸢劼 曹广力 薛仁宇 陈辉 贡成良 | 2012 | 水产学报2012，36，3： | 9 |
| 2 | 草鱼呼肠孤病毒研究进展显示文摘草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的主要品种,为四大家鱼之一,尤其在我国气候温暖的南方如长江、珠江水域养殖量极大。然而草鱼在幼苗阶段极易发病,其中威胁最大是草鱼出血病(grass carp hemorrhage),死亡率可高达90%以上。草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是草鱼出血病的主要病原,由于其高度传染性与致死性,对我国草鱼养殖业造成了极大的损失。近年来,关于草鱼呼肠孤病毒的研究逐步增多,并且出现了新基因型报道,引起了多方关注。对草鱼呼肠孤病毒的病原学、分子生物学、免疫原性、检测和综合防治等进行综述,并展望未来的研究方向,旨在对该病的防治和深入研究提供指导。 | 杨映 于辉 古勇明 | 2015 | 广东农业科学2015，42，15： | 9 |
| 3 | 草鱼呼肠孤病毒及其免疫防治研究进展显示文摘对草鱼呼肠孤病毒的形态结构、理化特性、分子生物学特性、免疫原性及其免疫防治等研究进行了综述,并提出其今后的研究方向,以期为更好地防治鱼出血病提供指导. | 肖波 | 2010 | 鲁东大学学报(自然科学版)2010，26，1： | 8 |
| 4 | 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建显示文摘根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2.1载体上,经酶切、PCR扩增检测和序列测定确认后,将其克隆到携带绿色荧光蛋白标记的植物表达载体pCAMBIA1302上,成功构建了可将草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的植物载体pCAMBIA 1302-LTB-VP6。本研究旨为草鱼出血病可饲化转基因植物疫苗研制奠定基础。 | 周勇 曾令兵 范玉顶 罗晓松 徐进 肖艺 | 2011 | 中国水产科学2011，18，1： | 7 |
| 5 | 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建显示文摘以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。 | 周勇 范玉顶 徐进 李艳秋 肖艺 曾令兵 | 2009 | 淡水渔业2009，39，4： | 6 |
| 6 | 草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析显示文摘为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。 | 汤亚方 曾伟伟 王庆 王英英 石存斌 冯茹 高辉 王承宝 | 2018 | 淡水渔业2018，48，1： | 6 |
| 7 | The VP2 protein of grass carp reovirus(GCRV) expressed in a baculovirus exhibits RNA polymerase activity显示文摘The double-shelled grass carp reovirus(GCRV) is capable of endogenous RNA transcription and processing. Genome sequence analysis has revealed that the protein VP2, encoded by gene seg-ment 2(S2), is the putative RNA-dependent RNA polymerase(RdRp). In previous work, we have ex-pressed the functional region of VP2 that is associated with RNA polymerase activity(denoted as rVP2390-900) in E. coli and have prepared a polyclonal antibody against VP2. To characterize the GCRV RNA polymerase, a recombinant full-length VP2(rVP2) was first constructed and expressed in a baculovirus system, as a fusion protein with an attached His-tag. Immunofluorescence(IF) assays, together with immunoblot(IB) analyses from both expressed cell extracts and purified His-tagged rVP2, showed that rVP2 was successfully expressed in Sf9 cells. Further characterization of the replicase activity showed that purified rVP2 and GCRV particles exhibited poly(C)-dependent poly(G) polymerase activity. The RNA enzymatic activity required the divalent cation Mg2+, and was optimal at 28 °C. The results provide a foundation for further studies on the RNA polymerases of aquareoviruses during viral transcription and replication. | Liming Yan Huan Liu Xiaoming Li Qin Fang | 2014 | Virologica Sinica2014，29，2： | 4 |
| 8 | 草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估显示文摘为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14~20 cm,体质量60~120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。 | 刘林 徐诗英 李婧慧 邹勇 倪金俤 杨鸢劼 曹广力 薛仁宇 陈辉 贡成良 | 2012 | 中国水产科学2012，19，5： | 4 |
| 9 | 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究显示文摘根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。 | 苏岚 曾令兵 周勇 张辉 高正勇 张金凤 | 2012 | 淡水渔业2012，42，6： | 3 |
| 10 | 草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10编码蛋白多克隆抗体制备及其特性分析显示文摘为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期相符,目的蛋白主要存在于包涵体中;过Ni柱纯化、透析复性纯化后的重组蛋白纯度可达97.4%;间接ELISA测得制备的多克隆抗体效价约为1∶106,Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能识别HZ08毒株,表明S10编码蛋白为GCRV-HZ08株的结构蛋白。 | 李永刚 曾伟伟 王庆 殷亮 王英英 梁红茹 刘春 石存斌 吴淑勤 | 2014 | 水产学报2014，38，3： | 2 |
| 11 | 渔用口服疫苗递送系统的研究进展显示文摘随着全球集约化、工厂化养殖程度的不断提高,鱼类病害也急剧增加,每年因水产养殖病害问题而造成的直接经济损失超过百亿元,给各国水产养殖业健康发展带来巨大威胁。疫苗能够有效地提高水产动物的免疫力,不但能预防水产动物疾病大规模暴发,而且还能减少化学类药物的使用和降低对环境的污染,对于助推水产养殖业绿色和可持续发展具有重要意义[1-2]。免疫接种疫苗是防治鱼病非常有效的措施,其中渔用口服疫苗具有成本低、易接种、适用于不同规格的水产动物等优点,一直是国内外水产疫苗的研究热点[3]。然而,由于渔用口服疫苗易在胃、肠道中受到胃酸和消化酶作用而降解,免疫原性遭到严重破坏,保护率达不到预期效果[4]。因此,如何将口服疫苗安全高效地递送到目的部位,使其在体内保持较长时间且不被降解,从而有利于诱发机体的免疫应答反应,并达到增强免疫的效果,已成为口服疫苗研发的关键。 | 袁高亮 朱雷 孔祥会 | 2021 | 水产科学2021，40，4： | 1 |
| 12 | 草鱼呼肠孤病毒HZ08株外衣壳蛋白VP4的节段克隆表达和免疫学分析显示文摘目的原核表达草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S6基因特定保守区域编码的外衣壳蛋白VP4并探究其免疫原性,为草鱼出血病(GCHD)防治提供新思路。方法将VP4基因特定保守区域克隆到原核表达质粒p ET-32a(+)中,诱导表达并用镍柱进行纯化,用纯化的目的蛋白免疫SD大鼠获取免疫血清;应用ELISA检测实验组(重组蛋白皮下免疫大鼠)和对照组(PBS免疫大鼠)血清Ig G抗体滴度及亚类的水平;应用间接免疫荧光实验(IFA)检测r VP4抗血清对病毒的识别情况。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明p ET32a-VP4重组质粒构建成功;SDSPAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中获得高效表达,融合蛋白分子量约为43 k Da,且在37℃、1mmol/L IPTG条件下诱导表达效果最优;经亲和层析获得了高纯度蛋白;免疫大鼠6周后血清Ig G抗体滴度高达1∶819 200,Ig G1、Ig G2a水平差异无统计学意义(P>0.05);IFA结果显示抗血清组特异性荧光显著,而对照组未见荧光。结论 GCRV-HZ08 VP4具有良好的免疫原性,可诱导大鼠产生Th1/Th2混合型免疫反应,且r VP4抗血清可识别该病毒,为VP4作为疫苗候选分子提供了依据。 | 任鹏丽 陈庭金 黄艳 曾伟伟 余新炳 | 2016 | 热带医学杂志2016，16，2： | 1 |
| 13 | 草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白靶向灭活转基因P_0的构建显示文摘为探索草鱼出血病防治新技术,实验采用衣壳蛋白靶向灭活(capsid-targeted viral inactivation,CTVI)策略,利用Tgf2转座子元件,构建了带爪蟾EF1α或鲤热休克蛋白70两种不同启动子的CTVI转基因质粒p Tgf2-EF1α-VP3-SN或p Tgf2-Hsp70-VP3-SN。该2种质粒均包含GCRV衣壳蛋白VP3与金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus aureus nuclease,SN)融合表达阅读框。通过将2种CTVI转基因质粒与体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA共同显微注射入草鱼1~2细胞期受精卵,获得了带2种不同启动子的CTVI转基因草鱼群体。PCR和测序结果显示,2种转基因阳性草鱼基因组中均含有外源GCRV衣壳蛋白VP3与SN基因片段,阳性率分别为40.2%和37.0%,表明Tgf2转座子已成功介导CTVI融合表达基因整合到草鱼基因组中。本实验共获得了120尾P0CTVI转基因个体,为将来构建抗出血病草鱼新品系奠定了基础材料。 | 秦波 程洛单 陈杰 蒋霞云 邹曙明 | 2014 | 水产学报2014，38，12： | 0 |
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