兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b^(0,+)AT多克隆抗体的制备及其效价和特异性分析

查看全文 作　　者：[1]孙育平;[1]甘鲁飞;[1]夏伟光;[1]冯定远;[1]左建军

机构地区：[1]华南农业大学动物科学学院,广州510642

出　　处：《动物营养学报》索引2013年第25卷第5期,共12页

基　　金：国家973资金资助(2012CB124701) 摘　　要：为了获得兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b0,+AT多克隆抗体,并对多克隆抗体进行特异性分析,本试验利用鸡b0,+AT cDNA全序列(GenBank登录号HQ338713)进行生物信息学分析,预测其蛋白质理化性质、跨膜区域、二级结构及抗原表位,并设计出1段抗原多肽;构建鸡pET-32a(+)-b0,+AT质粒,原核表达融合蛋白经纯化后,注射于新西兰大白兔,经3次加强免疫后,制备兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体,并采用酶联免疫分析(ELISA)和蛋白质免疫印迹(Westernblot)技术分析其效价和特异性。结果如下:1)鸡肠道b0,+AT分子质量为53.8 ku,等电点为8.27,编码493个氨基酸,其中含33个强碱性氨基酸残基(K、R)、28个强酸性氨基酸残基(D、E)、235个疏水性氨基酸残基(A、I、L、F、W、V)、122个极性氨基酸残基(N、C、Q、S、T、Y);经推测,b0,+AT有12个跨膜螺旋结构,由32.05%α-螺旋、25.96%延伸链和41.99%无规则卷曲组成。2)成功构建了鸡pET-32a(+)-b0,+AT质粒并获得兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体,抗体效价可达到1∶204 800,且特异性较好。3)利用制备的兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体作为一抗,肠道组织膜蛋白为抗原,采用Western blot验证获得预期的特异性条带,一抗稀释比例为1∶4 000。结果提示,本试验成功制备了与膜蛋白b0,+AT特异性较好的多克隆抗体,同时其在鸡肠道组织中具有较好的应用效果。 关键词：鸡碱性氨基酸转运载体 b0,+AT 多克隆抗体

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