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| 1 | 用羟基磷灰石纳米粒作内耳基因治疗新载体的体内外研究显示文摘目的研制羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAT)纳米粒,评价其作为新的内耳基因转染载体的可能性。方法用化学共沉淀-水热合成法制备HAT载体。经DNA电泳做不同pH值和HAT含量的DNA结合实验,了解HAT纳米粒对DNA的结合和保护作用;用四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒对宫颈癌上皮Hela细胞的毒性;用Hela细胞和小鼠耳蜗原代螺旋神经节细胞做神经营养素3(neurotrophin 3,NB)体外转染实验(绿色荧光蛋白基因荧光显微镜法)及NB的蛋白印迹分析,观察HAT介导的NB基因对活细胞的体外转染能力和基因表达情况;经实验性兴奋性耳毒性损伤豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT纳米载体-含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒载体-NT3基因复合物(HAT—pEGFPC2-NT3),用免疫组化(二氨基联苯胺法)观察NT3在耳蜗的表达,以了解HAT纳米载体在活体动物耳蜗介导基因转染的能力。结果含量250.0μg/ml,pH值3~7是这种长约40~50nm的短棒状HAT纳米粒能完全结合重组质粒pEGFPC2-NT3的最低含量混悬液和最佳pH环境,并可有效保护基因不被核酸酶(DNase Ⅰ)破坏。四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒从62.5μg/ml至500.0μg/ml4种混悬液对Hela细胞存活率无明显影响,细胞形态无变化。EGFP荧光显微镜观察显示,HAT纳米载体对Hela细胞的基因转染率为15.7%±2.6%(-↑x±s);将HAT—pEGFPC2-NT3转染培养的小鼠耳蜗神经元,也可见明显的EGFP表达。NT3免疫组化显示,向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT—pEGFPC2-NT3,可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达。结论HAT纳米粒不仅可介导NT3基因的体外转染,而且可介导其耳蜗活体转染;尽管转染率有待提高,但由于没有病毒载体转染造成的生物威胁,仍不失为一种很有研究价值的非病毒型内耳基因治疗载体。 | 孙虹 蒋明 朱晒红 | 2008 | 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2008，43，1： | 16 |
| 2 | 慢病毒为载体的siRNA抑制肝星状细胞TIMP-1的表达显示文摘目的观察以慢病毒为载体,用含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、具有较强抑制作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后对TIMP-1表达的抑制作用。方法针对大鼠TIMP-1 mRNA基因序列挑选2个不同短片段(nt161~181和nt445~463),在体外构建为短发夹siRNA1、siRNA2表达载体后,将其包装为重组Lenti/siRNA1-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA2-TIMP-1/GFP,同时包装阴性对照Lenti/GFP(空载体组),并以滴度MOI=10感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,感染后3d,用流式细胞仪及荧光显微镜检测病毒的感染效率。分别在感染后7、9d用Western blotting方法检测TIMP-1蛋白表达情况。结果感染HSC-T6后细胞形态和增生速度未发生明显变化。流式细胞仪及荧光显微镜检查证实感染效率分别为:空载体组68.23%,siRNA1感染组57.93%,siRNA2感染组51.2%,与正常细胞相比,感染后7d和9d,siRNA1、siRNA2感染组TIMP-1蛋白表达均有所下降,但只有siRNA1感染组在感染后9d能显著抑制TIMP-1表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的重组Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP可短期有效抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6TIMP-1蛋白表达。 | 白艳锋 丛敏 王萍 刘天会 吴晓宁 杨爱婷 唐淑珍 马红 贾继东 尤红 | 2009 | 首都医科大学学报2009，30，3： | 0 |
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