| 1 | 基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建显示文摘目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimulatd gene 20,ISG20)mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株,测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失,同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为0.566和1.268,P>0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为1.522和1.733,P>0.05)均无明显升高;与野生型Caco-2细胞相比,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为6.763和6.777,P<0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为5.664和5.653,P<0.05)均显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株,该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体(interferon alpha/beta receptor,IFNAR)激活的下游分子被明显抑制,为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。 | 刘欣奕 安妮 章青 王宏 孔翔羽 王铭月 庞立丽 段招军 | 2023 | 中国生物制品学杂志2023，36，2： | 0 |
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