|
|
|
题名
|
作者
|
年代
|
出处
|
被引量
|
| 1 | CRISPR/Cas9系统在人类疾病中的研究应用进展显示文摘规律成簇的短回文重复序列(clustered regularly intespaced short palindromic repeats,CRISPR)/(CRISPR associated 9,Cas9)基因编辑技术是由细菌中的获得性免疫系统发展而来的,作为目前最有效最受欢迎的基因编辑工具,Cas9蛋白可在向导RNA的引导下对DNA进行定点切割,与转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)相比效率更高且成本更低。CRISPR/Cas9编辑系统应用于人类疾病研究,有望解决生命科学研究领域多种复杂的分子生物学难题,例如癌症。本文主要从人类疾病的基因治疗出发,重点介绍了该技术在各系统中疾病模型的建立以及在遗传疾病的治疗、病毒感染性疾病治疗、癌症研究等方面的应用,并讨论了这种先进分子技术的未来前景和尚存在的不足。 | 张庆颜 董小玉 臧乃亮 徐伟文 | 2018 | 分子诊断与治疗杂志2018，10，3： | 6 |
| 2 | CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞的GPR43基因抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能显示文摘目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43^-/-RAW264.7细胞),Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43^-/-RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后,RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43^-/-RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43^-/-RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。 | 徐方明 苏丛 伍婷 陈昊然 张鹏飞 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 | 2020 | 细胞与分子免疫学杂志2020，36，6： | 1 |
| 3 | Rev-erbβ基因敲除对肝癌HepG2细胞增殖和迁移侵袭的影响显示文摘目的探讨核受体Rev-erbβ基因敲除对肝癌HepG2细胞增殖和迁移的影响。方法首先采用对靶向基因进行特定DNA修饰的CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建Rev-erbβ基因敲除的HepG2细胞系。用Rev-erbβ打靶载体共转染到HepG2细胞,通过筛选、克隆化构建Rev-erbβ基因敲除HepG2细胞系,并采用PCR、测序和Western blot鉴定。以正常HepG2细胞为对照,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Rev-erbβ基因敲除对肿瘤迁移、侵袭相关基因表达的影响,采用MTT、细胞划痕、Transwell等实验检测Rev-erbβ基因敲除对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果成功构建一株Rev-erbβ基因完全敲除单克隆细胞系(经PCR、测序和Western blot鉴定),命名为HepG2 C5(Rev-erbβ^-/-)。qRT-PCR结果显示,Rev-erbβ基因敲除可以导致基质金属蛋白酶-2,-9基因(MMP2,MMP9)、细胞外基质蛋白1基因(ECM1)表达上调(P均<0.05),细胞黏附相关基因E-钙黏蛋白基因(CDH1)下降(P=0.05);MTT、细胞划痕、Transwell实验显示,并且HepG2 C5比对照细胞有更强的增殖、迁移与侵袭能力(P<0.05)。结论 Rev-erbβ基因敲除可以改变HepG2细胞与迁移、黏附相关基因的表达,进而影响HepG2细胞增殖、迁移与侵袭能力。 | 陈芳 赵俊丽 夏海滨 | 2019 | 四川大学学报(医学版)2019，50，4： | 0 |
| 4 | PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用显示文摘为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ^(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ^(-/-);PGRN^(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ^(-/-);PGRN^(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。 | 陈芳 杨沛艳 朱久玲 | 2018 | 生物工程学报2018，34，10： | 0 |
您所在的机构暂未开通此部分的功能，请联系管理员