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| 1 | 人骨形态蛋白-2可调控系统在大鼠骨髓间充质干细胞的表达显示文摘目的构建携带四环素真核诱导表达系统(Tet-on)调控的人骨形态发生蛋白2(h BMP-2)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞。方法设计目的基因h BMP-2引物,将扩增纯化的目的基因h BMP-2定向克隆至携带Tet-on的慢病毒GV347载体上并测序鉴定产物。h BMP-2-GV347质粒、空载的GV347质粒分别与辅助质粒共感染293T细胞以收获慢病毒浓缩液。用h BMP-2-GV347慢病毒转染大鼠BMSCs,得到h BMP-2阳性表达细胞,探索转染最佳感染复数(MOI)。用CCK8法比较BMSCs转染前后的增殖活性;强力霉素(DOX)诱导打开Tet-on,real-time PCR、Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况。结果 PCR后得到目的基因h BMP-2,定向克隆至携带Tet-on系统调控的GV347质粒上,经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的h BMP-2-GV347质粒。h BMP-2-GV347质粒与空载GV347质粒分别感染293T细胞后获得h BMP-2-GV347慢病毒浓缩液。在DOX诱导下,h BMP-2-GV347慢病毒载体在293T细胞内表达BMP-2蛋白。h BMP-2-GV347慢病毒载体转染最佳MOI值为9,且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强,并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA。结论本研究成功构建携带Tet-on系统调控h BMP-2慢病毒表达载体,转染BMSCs后在DOX调控下可持续高效表达BMP-2蛋白。 | 白波 黄弘轩 黄芳立 张姝江 杜秀藩 钱东阳 陈艺 姚咏嫦 | 2017 | 中华关节外科杂志(电子版)2017，11，6： | 3 |
| 2 | 利用Tet-On系统敲低PRDM5对BEAS-2B细胞增殖的影响显示文摘[目的]探讨利用dox诱导的Tet-On调控系统敲低PRDM5基因对人正常支气管上皮细胞BEAS-2B增殖的影响。[方法]构建敲低PRDM5基因的pLKO-Tet-On-PRDM5-shRNA慢病毒质粒,包装生产慢病毒并转染BEAS-2B细胞,以相同条件制备转染pLKO-Tet-On-control-shRNA的BEAS-2B细胞作为对照。WesternBlot法检测PRDM5蛋白的表达水平;MTT实验观察细胞增殖情况;平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡水平。[结果]在合适剂量的dox诱导下(0.5μg/mL),敲低组细胞中PRDM5蛋白表达明显低于对照组(P<0.05);各时间点OD值高于对照组(P<0.05);克隆形成数大于对照组(P<0.01);凋亡率低于对照组(P<0.01)。[结论]成功构建出Tet-On系统调控敲低PRDM5的BEAS-2B细胞系。PRDM5基因敲低可促进BEAS-2B细胞增殖并且抑制其凋亡。 | 王野 房丽娇 任媛媛 刘欣 | 2018 | 生物技术2018，28，6： | 0 |
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