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| 1 | 利用9R-GFP-PHD检测细胞膜上PIP2的动态变化显示文摘目的通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白,并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和IP3的结合能力以及细胞膜上PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶C-δ1的普列克同源域(PHD)、荧光蛋白GFP及细胞穿膜多肽9R融合以构建相应蛋白表达载体。利用原核表达体系BL21大肠埃希菌和镍柱进行重组蛋白的表达和纯化,其中GFP和9R-GFP为9R-GFP-PHD的对照蛋白。获取重组蛋白后,通过同位素实验和液体闪烁计数器,分别检测和比较GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD与[3H]标记的PIP2和IP3的结合能力以及之间的竞争性抑制。另外,利用MDCK细胞检测和比较孵育的GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD后,3种重组蛋白在细胞内的分布情况。通过图片相减处理和荧光实时定量分析MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD在ATP刺激后分布的动态变化,从而间接反映细胞膜上PIP2的水解变化。结果通过原核表达和镍柱纯化体系顺利获得了GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD重组蛋白。体外结合实验证实9R-GFP-PHD与PIP2和IP3均有很强的结合能力,而且IP3能竞争性抑制9R-GFP-PHD与PIP2的结合。在孵育了3种荧光融合蛋白后,荧光共聚焦显微镜观察发现9R-GFP主要分布在细胞质中,而9R-GFP-PHD特异性分布于细胞膜上。荧光实时定量分析显示,ATP刺激通过P2y受体激活磷脂酶C以水解PIP2,从而使MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD减少20%左右。结论本研究中构建的9R-GFP-PHD利用了细胞穿膜多肽、PHD与PIP2和IP3结合特性及GFP的荧光可视和定量分析特性,有效地检测细胞膜上PIP2的动态变化,将为今后进一步研究细胞内钙动员提供新的工具蛋白。 | 韩小建 万玉英 危永芳 杨章坚 张剑锋 | 2014 | 重庆医学2014，43，18： | 0 |
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