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| 1 | 弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析显示文摘目的构建弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;West-ernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。 | 钟晓芝 李文姝 张丽芳 石朝辉 陈俊 闵太善 | 2009 | 中国病原生物学杂志2009，4，7： | 4 |
| 2 | 弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1复合抗原优势表位免疫原性研究显示文摘目的分析弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAGl)复合抗原免疫优势表位的免疫原性。方法利用生物信息学技术预测和筛选出弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势T、B淋巴细胞表位组合,将优势表位相应基因片段克隆至pET32a(+)载体并转化至表达感受态(大肠埃希菌Rosetta菌株)中诱导表达,通过离子螯合亲和层析柱(Ni—NTA)纯化表达产物,经SDS—PAGE鉴定表达产物纯化效果。以纯化的优势表位蛋白作为免疫原,皮下多点注射日本大耳兔,设pET32a(+)载体蛋白和PBS为对照,以纯化的优势表位蛋白作包被抗原,ELISA法检测第0、2和4周免疫兔血清中表位特异性抗体IgG的产生时间及效价,免疫斑点实验验证免疫兔血清多克隆抗体的特异性。以纯化的优势表位免疫BALB/c小鼠,酶联免疫斑点分析技术检测免疫鼠脾细胞7干扰素产生能力。结果在原核表达体系中获得了相对分子质量为30000的优势表位融合表达产物。纯化的表位蛋白免疫大耳白兔血清中可检测到相应的表位特异性抗体IgG,其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势,优势表位免疫组第2、4周兔血清抗体显著高于载体pET32a(+)蛋白对照组(1.454±0.098比0.616±0.084,F=0.000,P〈0.05;2.299±0.224比1.580±0.192,F=0.112,P〈O.05),第4周的免疫血清多克隆抗体效价可达1:40960。免疫斑点实验证实多克隆抗体针对优势表位具有良好的特异性。原核体系制备的优势表位蛋白免疫鼠脾细胞受3种不同的CTL表位肽刺激产生的7干扰素水平,分别为表位肽1[(19.333±1.528)/10万细胞]、表位肽2[(40.333±1.528)/10万细胞]、表位肽3E(70.667±1.890)/10万细胞],与PBS免疫对照组[表位肽1(1.033±0.150)/10万细胞、表位肽2(1.045±0.110)/10万细胞、表位肽3(1.041±0.120)/10万细胞]比较差异均有统计学意义(F值分别为0.284、0.000、0.284,均P〈0.05)。免疫鼠脾细胞受到优势表位中特异性CTL表位肽刺激后,γ干扰素产生水平显著升高,而且CTL表位联合Th表位的组合肽刺激(表位肽3),7干扰素产生水平分别显著高于单独的CTL表位肽刺激组(表位肽1和2,F值分别为5.796、0.000,均P〈0.05)。结论筛选的弓形虫复合抗原ROP2一SAGl免疫优势表位通过原核表达体系制备的重组表位蛋白,具有显著的免疫原性。 | 吕金辉 汪文寰 熊一融 杜王琪 叶璐璐 张丽芳 李文姝 | 2016 | 中华传染病杂志2016，34，1： | 2 |
| 3 | 弓形虫棒状体蛋白2多克隆抗体制备纯化及其在免疫荧光定位中的运用显示文摘目的制备弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)多克隆抗体并纯化。方法将已构建的重组质粒pET32aROP2转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中,用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白ROP2,分离上清和包涵体,包涵体洗涤后,用尿素溶解;取纯化蛋白与等体积福氏完全佐剂或不完全佐剂混合,背部皮下免疫新西兰大白兔3次,200μg/次,3次免疫之间分别间隔14 d和19 d,末次免疫10 d后收集兔血清,亲和纯化柱纯化,并用间接ELISA检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析抗体特异性。将弓形虫速殖子感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞),利用制备所得的多克隆抗体采用免疫荧光法检测ROP2在感染细胞中的定位。结果通过诱导表达,获得重组蛋白ROP2,制备的兔源性ROP2抗体纯化后为单一蛋白抗体。间接ELISA结果显示,抗体滴度为1∶102 400;Western blotting结果显示,抗体特异性良好。同时,免疫荧光定位试验结果显示,ROP2定位在弓形虫的纳虫泡膜上。结论本研究制备并纯化了抗弓形虫ROP2的兔源性多克隆抗体,并成功应用于ROP2在弓形虫纳虫泡膜上的免疫荧光定位试验。 | 张丽 廖启彬 胡琳 陈艾媛 魏海霞 彭鸿娟 | 2014 | 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2014，32，1： | 0 |
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