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| 1 | 组蛋白去乙酰化酶HDAC2突变体构建及其SUMO修饰E3连接酶功能研究显示文摘目的:针对人源HDAC2外显子拼接功能区(CDS)基因,运用双管法突变体构建技术,构建HDAC2去乙酰化酶功能失活的片段缺失与关键位点突变体,检测突变体的SUMO化修饰E3连接酶功能活性,探究此HDAC2新功能是否受到其固有的去乙酰化酶功能的影响。方法:设计HDAC2 100-322位氨基酸密码子缺失的片段突变体引物与142位H→A点突变体引物,利用HDAC2的pcDNA3.1真核表达质粒为模板,通过耐热Fusion酶PCR反应双管扩增相应的单链DNA,并经退火、模板酶切、乙醇纯化、感受态转化、抗性平板筛选、测序鉴定获得两种HDAC2去乙酰化酶功能失活的pcDNA3.1真核表达质粒。免疫印迹检测突变体质粒在细胞中的表达,荧光素酶(LUC)报告基因实验检测其SUMO化修饰E3连接酶功能活性。结果:成功构建HDAC2去乙酰化功能失活的片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2(DEL 100-322AA)与关键位点突变体pcDNA3.1/HDAC2(142 H→A)。C-myc标签的免疫印迹检测显示两种突变体在细胞中可稳定表达。将突变体转染进入三种细胞,LUC报告基因分析结果显示突变体仍具有E3连接酶功能活性。结论:HDAC2的E3连接酶功能不依赖于其去乙酰化酶活性,并且E3连接酶功能结构域位于其序列C端。 | 郭韡 熊渊 黄宏 邢伟 李向云 徐祥 | 2013 | 现代生物医学进展2013，13，6： | 2 |
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