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| 1 | 人caspase-1真核表达载体的构建及表达显示文摘目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S_1、S_2,利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES_2-EGFP载体,进行茵落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果从外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES_2-EGFP经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接,茵落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GeneBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES_2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES_2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。 | 李青春 张素华 马晓君 肖伟玲 梁淑娟 | 2009 | 潍坊医学院学报2009，31，3： | 0 |
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