| 2 | 人Leptin基因融合蛋白表达载体构建及对人成骨细胞的作用显示文摘背景:瘦素作为一种内分泌激素参与机体能量代谢的调节,近年来瘦素对骨代谢的调节作用也越来越被人们所重视。目的:克隆人Leptin基因,构建重组原核表达载体PEGX-5X-3/Leptin并在大肠杆菌中表达,观察Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长抑制作用。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-07/2008-05在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。材料:新鲜的脂肪组织取自苏州大学附一院(供者知情并同意)、大肠杆菌DH5α、人成骨细胞由苏州大学附属第一医院骨科实验室保种。方法:从人脂肪组织中提取RNA,采用反转录-聚合酶链式反应获得人Leptin全部序列,克隆入带有GST原核细胞表达载体PEGX-5X-3中,实现插入基因的融和表达,用SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定,提取并纯化GST-Leptin融合蛋白,以5,10,20,40mg/L不同质量浓度与人成骨细胞共培养,同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组,四甲基偶氮唑盐法测两组人成骨细胞的体外增殖情况。主要观察指标:①Leptin基因的克隆与鉴定。②重组质粒的双酶切及聚合酶链反应鉴定。③融合蛋白的表达。④GST-Leptin融合蛋白的纯化。⑤GST-Leptin融合蛋白的鉴定。⑥GST-Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长影响。结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到的特异性片段长度约为450bp,以此构建的重组质粒PEGX-5X-3/Leptin,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5kb和450bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中报道的完全一致,证明Leptin基因已成功地克隆到了原核表达载体PEGX-5X-3中。并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致,融合蛋白为Mr45000,GST蛋白为Mr29000,与GST蛋白组相比,20,40mg/L的GST-Leptin融合蛋白可以明显促进细胞的生长(P<0.05),且其促进作用有一定的浓度依赖性。结论:成功构建了PEGX-5X-3/Leptin重组原核表达载体,在E.coliBL21中表达GST-Leptin融合蛋白,并以浓度依赖性促进人成骨细胞的生长。 | 韩国胜 唐天驷 顾勇 董仁斌 陈亮 | 2009 | 中国组织工程研究与临床康复2009，13，7： | 1 |
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