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| 1 | 地方柴鸡中J亚群禽白血病与马立克氏病的混合感染显示文摘2008年9月,山东省菏泽市某柴鸡养殖专业户6 000只鸡80日龄时开始发病,至120日龄时死亡率高达15%。病鸡颜面苍白,机体进行性消瘦,瘫痪,最后衰竭死亡。部分鸡只可见单侧肢体麻痹症状和皮肤型肿瘤。对66份采自发病鸡群的血清及新生羽毛囊进行血清学检测。琼脂扩散试验结果显示所采的66份待检羽髓抗原MDV阳性率为59.09%,血清中MDV抗体阳性率为65.16%,抗原、抗体双阳性率为37.88%。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鸡血清中ALV-J、REV抗体,结果显示ALV-J抗体阳性率为7.58%,REV抗体检测全部呈阴性。剖检病鸡可见内脏器官普遍肿大,肝、脾、肾表面及切面有大小不等的灰白色肿瘤样结节。病理组织学观察肿大的器官和组织内都有不同程度的淋巴细胞增生,并可在肝、脾、肾、腺胃等组织内同时观察到淋巴细胞样瘤细胞和髓样瘤细胞2种典型的肿瘤灶。免疫组织化学检测结果表明,发病鸡组织内同时存在MDV和ALV-J抗原的阳性信号。PCR检测结果显示6只来检病鸡MDV和ALV-J均呈阳性,都扩增出相应的条带,REV未扩增出任何条带,PCR呈阴性。以上结果表明地方柴鸡鸡群中存在MDV和ALV-J的共感染,提醒我们应当注意地方柴鸡肿瘤性疾病的预防和净化工作。 | 张洪海 刘青 邱波 刘功振 成子强 | 2009 | 畜牧兽医学报2009，40，8： | 52 |
| 2 | 商品蛋鸡成髓细胞瘤、血管瘤型J亚群白血病病毒特性的研究显示文摘2007年7月山东某蛋鸡场150日龄海兰褐蛋鸡发病,前期经病理学和免疫组织化学检测证明和ALV—J密切相关。取4只病鸡的肝组织处理后接种鸡胚成纤维细胞(CEF)培养,用ALV—J单抗G2-3进行间接免疫荧光检测,结果呈现强阳性,将反应为阳性的4株病毒分别命名为WS0701、WS0702、WS0703和WS0704;根据ALV-J原型株HPRS-103的序列设计1对针对外源性ALV—J的引物P1和P2,提取阳性CEF基因组DNA作为模板,PCR扩增后,得到长度为924bp的片段;PCR扩增产物测序结果显示,与HPRS-103的同源性为95.0%~97.5%,与国内分离株的同源性为92.0%~95.9%;遗传变异分析结果表明成髓细胞瘤型、血管瘤型ALV-J与国内毒株的同源性较远,而与HPRS-103的同源性最近,这说明ALV—J在蛋鸡体内复制的过程中有返祖现象,并呈现了新的肿瘤学特征。 | 孟祥凯 刘青 王海伦 张洪海 邱波 刘功振 成子强 | 2008 | 畜牧兽医学报2008，39，11： | 17 |
| 3 | 感染J亚群禽白血病病毒的蛋鸡群中检测出B亚群禽白血病病毒显示文摘通过血清学、病理学以及病毒学检测,首次在国内从感染ALV-J的海蓝白商品蛋鸡群中分离到B亚群禽白血病病毒(ALV-B)。ELISA检测该鸡场血清样品(92份)显示,ALV-A/B型抗体阳性率为16.3%,ALV-J抗体阳性率为13%,其中有1只鸡呈现抗体双阳性。取3只表现临床症状病鸡做病理组织学观察,在肝脏同一位置发现淋巴细胞样瘤细胞和髓细胞样瘤细胞增生灶,其它组织器官(除脑、神经和法氏囊)也有不同程度的两种瘤细胞增生。根据文献设计合成ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV和REV的特异性引物。取该3只病鸡肝脏病料研磨接种DF-1细胞,培养7-10天后提取培养细胞DNA,PCR扩增获得1 100bp的ALV-B特异性片段和924bp的ALV-J特异性片段,其中有1只鸡为ALV-B和ALV-J双阳性,而ALV-A、MDV、REV的PCR结果为阴性,因此获得ALV-B和ALV-J各两株分离株。对ALV-B、ALV-J扩增序列进行遗传进化树分析表明,两ALV-B分离株与其代表株的同源性分别为92.8%和94.7%;两ALV-J分离株与英国原型株同源性分别为96.9%和91.5%,与美国原型株同源性为85.9%和81.5%,与国内分离毒株同源性在87.0%~98.7%之间。本研究在国内分离到ALV—B毒株,并证实了ALV-B、J在同一只鸡体内的混合感染,应引起养禽业及相关研究部门的高度重视。 | 刘功振 张洪海 刘青 邱波 王峰 王晓伟 陈洪博 成子强 | 2009 | 病毒学报2009，25，6： | 14 |
| 4 | 巢式PCR技术在输入性卵形疟诊断中的应用研究显示文摘目的应用巢式PCR扩增小亚单位核糖体核糖核酸(18S r RNA)基因确诊卵形疟原虫感染。方法采集2012-2013年山东省疟疾患者全血和滤纸血样,吉氏染色镜检观察血膜疟原虫形态并鉴定虫种。提取血样中DNA,根据疟原虫18S r RNA基因以属和种特异性引物进行巢式PCR扩增,筛查卵形疟阳性标本并进行测序验证。结果2012和2013年山东省共筛查到7例输入性卵形疟原虫感染病例。巢式PCR扩增7份血样均在800 bp处出现卵形疟原虫特异性单一条带,Blast比对表明产物序列与Gen Bank卵形疟参考序列一致。结论经巢式PCR方法确诊了2012和2013年山东省7例输入性卵形疟病例。 | 黄炳成 徐超 李瑾 肖婷 尹昆 刘功振 王卫艳 赵桂华 魏艳彬 王用斌 赵长磊 魏庆宽 | 2015 | 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2015，33，1： | 12 |
| 5 | 弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展显示文摘棒状体蛋白16(ROP16)是弓形虫棒状体蛋白家族成员,其蛋白结构存在丝氨酸、苏氨酸激酶区,是弓形虫入侵过程中的重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核,能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT3/6,干扰宿主细胞信号通路传导,在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。本文对弓形虫ROP16的发现、功能、免疫保护性等方面进行综述。 | 刘功振 王彬 王洪法 | 2015 | 中国血吸虫病防治杂志2015，27，2： | 10 |
| 6 | 弓形虫ROP21基因的原核表达与免疫学鉴定显示文摘目的原核表达弓形虫棒状体ROP21基因,并对rROP21蛋白进行免疫学鉴定。方法根据已发表的ROP21基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP21基因。将ROP21基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)后转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后进行SDS-PAGE分析、Western blot及IFA分析。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体。重组质粒转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,重组蛋白(rROP21)以包涵体形式高效表达,分子质量单位约为45ku。Western blot显示重组rROP21蛋白能被his标签抗体及弓形虫病患者血清识别。用rROP21免疫小鼠,获得滴度为1∶104的抗体血清。IFA显示弓形虫速殖子体内存在ROP21蛋白。结论构建的重组质粒pET28a-ROP21表达的弓形虫rROP21具有抗性,可作为血清学诊断候选抗原,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 | 李瑾 孙慧 崔勇 王洪法 刘学峰 于泓 赵桂华 尹昆 仲维霞 徐超 肖婷 魏庆宽 黄炳成 刘功振 | 2016 | 中国病原生物学杂志2016，11，11： | 9 |
| 7 | 新生儿及婴儿TORCH感染血清学检测分析显示文摘目的了解青岛地区新生儿及婴儿TORCH感染状况和感染特点。方法应用间接化学发光免疫分析法(CLIA)检测1 196例新生儿和婴儿血清中的TORCH特异性抗体,并进行统计分析。结果受检患儿中TORCH-IgM阳性率为1.67%,其中以CMV和HSV感染为主;患儿中TORCH-IgG抗体阳性率为99.16%,其中以CMV感染最常见,阳性率为94.31%;患儿混合感染率达到93.31%,以HSV和CMV混合感染为最多,阳性率达85.45%;新生儿及婴儿IgG抗体检测均以CMV-IgG抗体阳性率最高,分别为96.28%、82.76%;男性和女性患儿CMV-IgG阳性率均为最高,分别为94.36%、94.27%。结论青岛地区TORCH感染以CMV、HSV感染及二者混合感染为主,既往感染阳性率较高,新近感染阳性率较低,新近感染患儿并发症主要是呼吸系统和消化系统疾病,因此,加强新生儿和婴儿TORCH抗体检测筛查,对辅助临床鉴别和治疗具有重要的意义。 | 杨琰琰 刘功振 | 2019 | 国际检验医学杂志2019，40，8： | 6 |
| 8 | 山东省肉种鸡群三种家禽肿瘤性疾病流行病学调查显示文摘为调查山东省家禽肿瘤性疾病的流行情况,本研究以血清学、病理组织学、免疫组织化学、病原学等检测手段,在山东省境内17家AA种鸡场进行检测。血清学试验结果显示:马立克氏病病毒(MDV)平均抗原阳性率为1.87%;禽白血病病毒J亚群(ALV-J)和网状内皮组织增生症病毒(REV)平均抗体阳性率分别为9.52%和39.78%;双重及三重感染,MDV+ALV-J、MDV+REV、ALV-J+REV及MDV+ALV-J+REV感染率分别为1.12%、1.21%、3.92%和0.65%。对57羽疑似肿瘤病的病鸡检测显示:MDV、ALV-J和REV的抗体阳性率分别为19.3%、47.37%和57.89%;MDV+ALV-J、MDV+REV和ALV-J+REV的双阳性率分别为1.75%、3.5%和19.3%;无三重感染。病理组织学观察显示:病鸡体内既有各病毒引起的单纯肿瘤,也有双重肿瘤共存的现象。免疫组织化学检测显示,MDV、ALV-J和REV抗原阳性信号在病鸡中的比例分别为38.6%、54.39%和28.07%。PCR检测结果表明:MDV、ALV-J和REV的阳性率分别为43.86%、64.91%和33.33%;MDV+ALV-J、MDV+REV、ALV-J+REV和MDV+ALV-J+REV阳性率分别为15.79%、10.53%、12.28%和7.02%。本研究结果表明,山东省境内AA肉鸡群中仍存在较高的肿瘤性病毒感染率。 | 张利 张洪海 刘青 刘功振 邱波 刘建柱 郭慧君 成子强 | 2011 | 中国预防兽医学报2011，33，4： | 4 |
| 9 | 诱发血管瘤型J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达显示文摘2007年7月至11月,中国开产前后的商品海兰褐蛋鸡群大面积暴发血管瘤,造成巨大经济损失。将病料接种DF1细胞,通过PCR和间接免疫荧光(IFA)确定此次暴发的血管瘤为J亚群白血病病毒(ALV-J)感染引起。从患病鸡群中分离到5株ALV-J(前4株已经报道),将第5株病毒命名为WS0705。为研究该毒株抗原性的特点,用PCR方法扩增出gp85基因,并克隆进pMD18-T载体进行测序。氨基酸系统进化树分析显示WS0705与英国ALV-J原型毒株HPRS-103同源性最高。从已构建的质粒pMD18-T-WS0705gp85中酶切回收gp85基因,构建重组转移载体pFastBacH Tb-WS0705gp85。利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-WS0705gp85。间接免疫荧光和Western blot检测WS0705gp85基因的表达产物。间接免疫荧光显示,构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞呈现明显的强阳性反应;Western blot分析,重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35kD的阳性条带。结果表明,WS0705gp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达,并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别,进一步证明本次暴发血管瘤的病原为ALV-J,并为进一步开发ALV-J相关诊断产品奠定了基础。 | 邱波 刘功振 王晓伟 王峰 陈洪博 成子强 | 2011 | 病毒学报2011，27，2： | 4 |
| 10 | 弓形虫Toxofilin蛋白基因克隆和生物信息学分析显示文摘目的运用生物信息学方法预测分析弓形虫Toxofilin基因编码蛋白的功能域及三级结构。方法 PCR扩增Toxofilin全长基因序列,利用SignaIP和TMHMM在线网站预测分析其编码蛋白的信号肽、跨膜区;利用DNAStar软件分析Toxofilin蛋白的亲水性、抗原指数;联合运用ExPASY和PRODATA分析Toxofilin蛋白的功能域及三级结构。结果 PCR扩增Toxofilin基因大小为738bp。DNAstar分析其编码蛋白Toxofilin序列存在典型信号肽,但不存在跨膜区,在其N端存在较高的亲水性基团和抗原指数。ExPASY分析Toxofilin蛋白存在酰基化、磷酸化蛋白激酶位点。结论 Toxofilin蛋白含有信号肽和磷酸化位点等功能域,抗原指数,为验证Toxofilin功能奠定了理论基础。 | 王利磊 杨琰琰 王洪法 刘源璟 刘功振 | 2017 | 中国病原生物学杂志2017，12，8： | 4 |
| 11 | pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建与鉴定显示文摘目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中。应用聚合酶链反应(PCR)初筛,再采用酶切、测序等技术对构建的重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2进行鉴定。结果 PCR扩增出HBsAg基因片段,构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体。PCR与酶切结果显示,该基因片段大小均与理论值相符;测序结果显示该重组表达载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列。结论成功构建了多基因重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2,为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。 | 魏庆宽 王英婷 闫运琴 肖婷 李瑾 徐超 刘功振 刘娟美 仲维霞 尹昆 付斌 闫歌 黄炳成 | 2014 | 中国血吸虫病防治杂志2014，26，1： | 4 |
| 12 | 弓形虫TgROP21基因克隆及生物信息学分析显示文摘PCR扩增弓形虫棒状体蛋白21(Tg ROP21)全长基因序列,利用Signa IP和TMHMM在线网站预测分析其信号肽、跨膜区;DNAStar软件分析其亲水性、抗原指数;联合运用Ex PASY和PRODATA在线网站对Tg ROP21的功能域及三级结构进行建模。PCR产物可见1条2 022 bp左右的片段,与预期片段大小相同。成功预测出Tg ROP21的信号肽、跨膜区、亲水性、抗原指数、功能域和三级结构。 | 史世俊 崔勇 李瑾 王洪法 尹昆 魏庆宽 黄炳成 孙慧 刘功振 | 2015 | 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2015，33，4： | 4 |
| 13 | 刚地弓形虫RH株速殖子体外入侵小鼠巨噬细胞系感染模型的构建显示文摘目的建立刚地弓形虫(简称弓形虫)RH株速殖子体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,确定体外快速高效培养速殖子的方法。方法弓形虫RH株速殖子经昆明小鼠传代3次后,经5μm滤膜纯化计数后,与小鼠巨噬细胞RAW264.7、人包皮成纤维(HFF)细胞共培养。RAW264.7细胞与虫体数量比例分别为20:1、10:1、1:1、1:5,HFF细胞与虫体比例为1:1,设无虫对照组。分别于培养后10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、32 h、48 h时间点取样,高倍镜下观察共培养情况,瑞-吉氏染色观察速殖子的黏附入侵细胞情况。将速殖子以1.5×10^(6)个/瓶接种于RAW264.7 T25细胞培养瓶中共培养,待80%假包囊破裂后,收集速殖子并计数,计算速殖子产率。用0.4%台盼蓝染液染色后,计算培养体系的活虫率。回收的弓形虫速殖子继续感染新的RAW264.7细胞,将每代细胞中收集的速殖子以1×10^(6)个/只接种5只健康雌性昆明小鼠,同时以等量的第3代速殖子接种5只健康雌性昆明小鼠作为对照,记录每代小鼠的存活时间。应用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。结果当RAW264.7细胞与虫体比例大于10:1时,共培养24 h时可见细胞边界不清,胞质增加,出现大量小泡;共培养30 h时细胞大量死亡消失,未观察到游离弓形虫;当细胞与虫体比例小于或等于1:1时,共培养24 h时内胞质可见细密小颗粒,未见小泡;共培养30 h时假包囊破裂达90%以上,大量速殖子被释放至培养液中,可观察到速殖子体外发育的完整过程。速殖子与RAW264.7细胞以1:1的比例共培养0.5~1 h,约80%的速殖子侵入细胞,虫体可进入胞质和胞核,2~4 h后假包囊开始形成,8 h可见菊花状假包囊;24 h后假包囊开始破裂,32 h后细胞悬浮不贴壁,大部分假包囊破裂并释放出游离速殖子,虫体形态好,每瓶收获弓形虫速殖子6×10^(8)个,平均活虫率在92%以上。速殖子与HFF细胞共培养,2~4 h虫体基本入侵细胞;8 h后速殖子开始分裂增殖;共培养24 h,可见速殖子分裂成菊花状;36 h后细胞开始涨破,释放出的速殖子开始新一轮入侵HFF细胞。体外培养各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为3.94~4.10 d,经与昆明小鼠体内传代复毒虫株相比毒力未见减弱。结论采用小鼠巨噬细胞RAW264.7可在体外培养快速获得大量弓形虫RH株速殖子,产率为体内培养方法的400倍,且虫体毒力与体内培养方法相当,培养时间和产率上也均优于HFF细胞系。 | 张丽新 赵桂华 徐超 肖婷 孙慧 李瑾 刘功振 尹昆 | 2021 | 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2021，39，4： | 3 |
| 14 | 弓形虫GRA6基因的重组、表达及鉴定显示文摘目的构建弓形虫致密颗粒蛋白6(GRA6)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据弓形虫GRA6基因序列设计并合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA6基因片段,扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶切鉴定并测序后,将重组质粒转化大肠埃希菌BL21后并用IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blot分析其反应原性。结果以弓形虫DNA为模板扩增GRA6基因片段,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物大小为693bp,与理论值相符;重组质粒经酶切鉴定构建成功,测序结果与GenBank上弓形虫RH株GRA6序列AF239283.1同源性100%;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA6融合蛋白分子质量单位约为52ku,与GST-GRA6的理论分子质量相符,该融合蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA6基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。 | 李瑾 魏庆宽 贾凤菊 徐超 肖婷 王卫艳 尹昆 刘功振 黄炳成 | 2015 | 中国病原生物学杂志2015，10，3： | 3 |
| 15 | 刚地弓形虫微线蛋白16基因片段原核表达、纯化及免疫反应性分析显示文摘目的原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)微线蛋白16(micronemal protein 16,Tg MIC16)的3个基因片段,并分析3个重组蛋白的免疫反应性。方法参照Gen Bank中Tg MIC16基因序列,根据功能活性区将其分为3个片段(M16D1、M16D2、M16D3),分别设计引物,以刚地弓形虫RH株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR扩增,获得预期的3个DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体p ET-32a(+),将重组质粒转化入大肠埃希菌(Escherichia coli)TOP10,经PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosetta,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。重组蛋白经镍柱纯化后,分别以抗组氨酸(His)单抗和弓形虫感染兔血清为一抗,Western blotting分析其免疫反应性。结果 Tg MIC16 3个基因片段的RT-PCR扩增产物分别为1 806、1 290、855 bp。双酶切和测序结果显示,3个Tg MIC16片段的重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE分析结果显示,3个重组蛋白成功表达,且均为以包涵体的形式表达,相对分子质量(M_r)分别为88 000、68 000、52 000。Western blotting分析结果显示,3个纯化的表达蛋白均能被抗His单抗和弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建并表达Tg MIC16的3个功能活性区,且3个重组蛋白均表现出良好的免疫反应性。 | 李瑾 崔勇 尹昆 刘功振 肖婷 徐超 魏庆宽 黄炳成 孙慧 | 2016 | 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2016，34，3： | 2 |
| 16 | pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达显示文摘目的构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达。方法根据pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600bp,与理论值相符。构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700bp和约2 600bp的两条片段,与预期相符。对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变。免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40mg/ml。提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别。结论成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础。 | 肖婷 毛德华 李瑾 黄炳成 徐超 尹昆 王龙江 赵桂华 崔勇 朱嵩 刘功振 魏庆宽 孙慧 | 2018 | 中国病原生物学杂志2018，13，10： | 2 |
| 17 | 麻鸡J亚群白血病与组织滴虫混合感染显示文摘 | 刘功振 刘学峰 刘鹏 成子强 孟祥凯 刘青 张洪海 邱波 | 2009 | 中国兽医杂志2009，45，10： | 2 |
| 18 | 猫肠上皮细胞的原代培养及cDNA文库的构建显示文摘目的建立猫肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)培养体系,构建其酵母双杂交cDNA文库,为筛选弓形虫毒性因子在终末宿主的互作蛋白奠定基础。方法分别采用组织块法以及低浓度胶原蛋白酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法进行猫IECs的原代培养,通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法鉴定后提取mRNA,运用SMART技术合成cDNA第一链,以LD-PCR扩增获得双链cDNA(ds cDNA),通过同源重组方法在酵母菌株Y187中构建猫IECs的cDNA文库,计算文库的容量,以酵母菌液PCR检测插入片段的大小分布。结果两种培养方法效果表明酶联合消化法更为有效。本研究建立了连续培养猫IECs体系,培养出高纯度的猫IECs,用其构建的cDNA文库容量为1.1×10~6,滴度为2.8×10~9cfu/ml,插入片段大小在0.5~2.0 kb之间。结论培养的原代猫IECs构建的cDNA文库符合酵母双杂交筛选互作因子标准,这为筛选弓形虫终末宿主的毒性因子互作蛋白奠定了基础。 | 刘烨 赵桂华 尹昆 王洪法 肖婷 刘功振 仲维霞 崔勇 | 2017 | 中国血吸虫病防治杂志2017，29，4： | 2 |
| 19 | 弓形虫ROP21诱饵质粒的构建与自激活鉴定显示文摘目的筛选与弓形虫ROP21相互作用的宿主蛋白。方法构建弓形虫ROP21基因的三个诱饵载体,通过酵母双杂交技术分别对其在Y2H Gold酵母菌中的毒性和自激活进行鉴定。提取弓形虫RNA并进行反转录,采用RT-PCR方法扩增得到弓形虫ROP21全长序列,根据其不同功能区构建全长或部分序列诱饵质粒,测序后分别命名为pGBKT7-ROP21、pGBKT7-LC和pGBKT7-ST。将重组的诱饵载体转化到Y2H酿酒酵母菌,在营养缺陷型培养基上观察该重组诱饵载体的毒性和自激活现象。结果发现三个质粒转化酵母菌后,pGBKT7-ROP21和pGBKT7-ST存在自激活现象,而pGBKT7-LC转化酵母菌不存在,因此其可以作为酵母双杂交筛选的诱饵质粒。结论为进一步运用酵母双杂交技术筛选与弓形虫ROP21互作的宿主蛋白奠定了基础。 | 崔勇 李瑾 王洪法 田宝振 尹昆 赵桂华 孙慧 魏庆宽 徐超 黄炳成 刘功振 | 2018 | 中国病原生物学杂志2018，13，11： | 2 |
| 20 | 弓形虫毒力效应因子ROP18竞争性抑制剂的筛选及亲和活性分析显示文摘目的采用药物靶标虚拟筛选技术筛选靶向弓形虫毒性因子ROP18的小分子竞争性抑制剂,并对中靶小分子进行活性分析。方法通过MOE软件的Structure Prepare完成ROP18三维晶体结构的结构准备;以ATP结合口袋作为筛选起点,分别参考EHT药效团注释及构建方法,以及TypeⅠ激酶抑制剂药效团特征构建靶向天然配体口袋的药效团;通过Pharmacophore Search导入包含202 919个化合物优势构象的SPECS数据库,通过EHT药效团注释方法进行小分子相似性筛选;筛选的小分子经分子对接和打分函数排序后,对排名前100的分子构象进行SAR分析。结果构建的药效团模型具有4个典型的TypeⅠ激酶抑制剂特征,保证了筛选的多样性和互作特异性;在SPECS数据库中共计通过了1 314个符合该模型的小分子,最终选取了25种活性较高的小分子。这些小分子具有2种母环核心Scaffold骨架聚类,分别命名为ScaffoldⅠ类及ScaffoldⅡ类。另有13种Scaffold各异的化合物类型。结论成功构建了靶向ROP18的ATP-结合口袋的药效团模型,筛选得到25种代表性小分子,形成2种Scaffold聚类及13种多样性骨架结构,为开发新型抗弓形虫病药物先导物奠定了基础。 | 邱潇 程允堂 王利磊 赵桂华 姚营营 徐超 孙慧 刘功振 肖婷 朱嵩 魏庆宽 黄炳成 闫歌 尹昆 | 2019 | 中国病原生物学杂志2019，14，3： | 2 |
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